基于探針法和熔解曲線分析法，結(jié)合多色熒光檢測，可同時檢測一個反應中的多個靶標。其探針采用雙標記、自淬滅的TaqMan探針或分子信標，檢測原理為：當TaqMan探針游離于溶液中處于無規(guī)則卷曲狀態(tài)時，或分子信標由于莖部堿基的互補配對形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)時，探針上標記的熒光基團與淬滅基團相對靠近，因熒光能量共振轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)使得熒光信號較弱。而當反應體系中存在靶標序列時，探針與靶標序列互補配對，形成伸展狀態(tài)，熒光基團和淬滅基團相對遠離，發(fā)射出較強的熒光信號。當擴增完成，產(chǎn)物量達到最高峰，熒光信號也最強，此時再對擴增產(chǎn)物進行升溫檢測，則雜交在產(chǎn)物上的探針與靶標序列逐漸解離，形成無規(guī)則卷曲狀態(tài)，熒光信號逐漸減弱，繪制溫度與熒光信號的變化曲線圖，即可進行熔解曲線分析。
